Действие игры происходит в вымышленной лечебнице Аркхэм для душевнобольных и опаснейших преступников, которая находится у побережья Готэм-Сити. В Arkham Asylum используется огромное количество персонажей, взятых из комиксов о Бэтмене. Три актёра озвучки, ранее работавшие над анимационными проектами от DC, повторили свои роли в игре — Кевин Конрой озвучил Бэтмена (Брюса Уэйна) — супергероя, превосходного тактика и эксперта боевых искусств, Марк Хэмилл озвучил заклятого врага Бэтмена, Джокера, а его подругу Харли Квинн — Арлин Соркин. Бэтмену помогают союзники в лице Оракул (Кимберли Брукс), которая дистанционно общается с героем и предоставляет ему разведданные, и комиссара полиции Джеймса Гордона .